标题：The PopGRF3-PopKNAT3 module orchestrates salt tolerance through transcriptional control of stress-responsive genes in poplar

译名：PopGRF3-PopKNAT3通路通过调控杨树胁迫响应基因的转录来调控耐盐性

期刊：New Phytologist

IF：8.1

通讯作者：Dongyan He1

作者单位：北京林业大学

一、研究创新性：三大突破填补木本植物耐盐研究空白

该研究聚焦杨树这一重要造林树种，在植物耐盐分子调控研究中实现了多项关键创新，打破了此前的研究局限：

1. 首次鉴定木本植物GRF-KNAT互作模块：此前GRF和KNAT家族基因的耐盐功能研究多集中在草本植物（拟南芥、水稻），本研究首次发现杨树中PopGRF3与PopKNAT3形成蛋白复合物，揭示了木本植物特有的耐盐转录调控模式。

2. 阐明“蛋白互作解除转录抑制”的新机制：明确PopGRF3作为负调控因子直接抑制PopNHX2表达，而PopKNAT3不直接结合PopNHX2启动子，而是通过与PopGRF3互作阻断其DNA结合能力，解除对PopNHX2的转录抑制，为植物转录调控的“蛋白互作调控”模式增添新案例。

3. 整合离子稳态与氧化应激双重调控通路：证实该模块通过调控PopNHX2（Na⁺/H⁺反向转运蛋白）实现离子平衡，同时调控抗氧化酶系统缓解氧化损伤，阐明了杨树耐盐过程中“离子调控-氧化防御”的协同调控机制。

二、研究背景：植物耐盐的分子基础与科学问题

植物作为固着生物，进化出了复杂的耐盐调控网络，维持Na⁺/K⁺离子稳态和清除活性氧（ROS）是其应对盐胁迫的两大核心策略：

1. 离子稳态调控：盐胁迫下胞内过量Na⁺会破坏代谢平衡，植物主要通过Na⁺/H⁺反向转运蛋白（如NHX家族）将Na⁺区隔化至液泡或外排至胞外，其中液泡型NHX2是介导Na⁺区隔化的关键基因，但其在杨树中的转录调控机制此前尚未明确。

2. 氧化应激防御：盐胁迫会诱导ROS大量积累，引发细胞膜脂质过氧化（如MDA积累），植物通过超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等抗氧化酶清除ROS，而该过程的转录调控与离子稳态的协同机制仍有待解析。

3. 转录因子的核心调控作用：生长调节因子（GRF）和KNOX家族转录因子（KNAT）在植物生长发育和非生物胁迫响应中发挥重要作用，但GRF3在木本植物耐盐中的功能、KNAT3与GRF3的互作关系，以及二者如何调控下游耐盐基因，均为亟待解决的科学问题。

基于此，该研究以银腺杨84K（Populus alba × P. glandulosa）为材料，围绕“PopGRF3的耐盐功能-下游靶基因鉴定-互作蛋白筛选-调控机制解析”展开系统研究，最终揭示了PopGRF3-PopKNAT3-PopNHX2的耐盐调控通路。

三、方法概述：多技术融合的系统生物学研究策略

该研究综合运用分子生物学、细胞生物学、转录组学、反向遗传学等多种技术手段，从基因功能、蛋白互作、转录调控、生理生化四个层面验证科学假说，实验设计严谨、技术手段全面，具体包括以下核心方法：

1. 转基因材料创制：构建PopGRF3/PopKNAT3/PopNHX2的过表达（OE）和RNA干扰（RNAi）转基因杨树株系，为基因功能验证提供材料基础；同时利用烟草瞬时表达系统开展亚细胞定位、双荧光素酶报告基因（DLR）等实验。

2. 转录组与表观遗传分析：通过RNA-seq筛选PopGRF3调控的差异表达基因，利用DNA亲和纯化测序（DAP-seq）鉴定 PopGRF3 的全基因组结合位点，结合Motif分析确定其核心结合顺式元件（CTGACA）。

3. 蛋白互作验证：采用酵母双杂交（Y2H）、双分子荧光互补（BiFC）、萤光素酶互补成像（LCI）、体外Pull-down等多种方法，层层验证PopGRF3与PopKNAT3的互作。

4. 转录调控验证：通过电泳迁移率变动分析（EMSA）、酵母单杂交（Y1H）、DLR实验，证实PopGRF3直接结合PopNHX2启动子并抑制其表达，而PopKNAT3解除该抑制作用。

5. 生理生化与表型分析：测定盐胁迫下转基因植株的鲜重、叶绿素含量、相对含水量（RWC）等表型指标，检测Na⁺/K⁺比值、ROS（H₂O₂、O₂⁻）积累、抗氧化酶活性、膜脂过氧化程度（MDA）等生理生化指标，结合DAB/NBT组织化学染色，全面解析基因功能。

6. 生物信息学分析：利用TGMI算法筛选盐胁迫响应的关键转录因子，通过GO富集分析、共表达网络分析，挖掘基因调控的生物学通路。

四、核心结果深度解析：PopGRF3-PopKNAT3模块调控杨树耐盐的分子机制

该研究通过一系列实验，逐步阐明了PopGRF3作为耐盐负调控因子，与正调控因子 PopKNAT3互作，解除对PopNHX2的转录抑制，进而通过维持离子稳态和增强氧化防御提升杨树耐盐性的核心机制。

·PopGRF3通过调控离子稳态与抗氧化系统负向调控杨树耐盐性

核心结论：PopGRF3是杨树盐胁迫响应过程中的核心负调控因子，其表达水平直接调控杨树耐盐性强弱；过表达PopGRF3会显著降低杨树的盐胁迫耐受性，使植株在盐处理下表现出更严重的生长抑制，而通过RNAi技术干扰PopGRF3的表达后，杨树的耐盐能力得到显著增强。该基因主要通过抑制盐胁迫下杨树的抗氧化防御系统激活、破坏细胞内Na⁺/K⁺离子稳态平衡，同时降低植株物质积累能力和水分保持能力，最终加剧盐胁迫对杨树的生长抑制和氧化损伤，反之，敲低该基因的表达则能有效缓解上述盐胁迫伤害，提升植株对盐环境的适应能力。

图（1）

图 1：PopGRF3负调控杨树的盐胁迫耐受性

·PopGRF3特异性结合CTGACA基序抑制PopNHX2转录

核心结论：PopNHX2是PopGRF3介导盐胁迫响应的关键直接下游靶基因，PopGRF3作为转录抑制因子，可特异性识别并结合PopNHX2启动子区域的CTGACA顺式作用元件，在植物体内直接抑制PopNHX2的转录启动活性，进而调控该基因的表达水平；同时转录组分析证实PopGRF3广泛调控离子跨膜运输、盐胁迫响应等通路相关基因，为其介导的耐盐调控机制提供了转录组层面的支撑。

图（2）

图 2：PopGRF3直接结合 PopNHX2启动子并抑制其表达

·PopNHX2通过离子稳态与抗氧化防御正向调控杨树耐盐性

核心结论：PopNHX2是杨树盐胁迫响应中的核心正调控因子，也是PopGRF3介导耐盐调控的关键下游效应基因，其表达受盐胁迫诱导并随处理时间呈现上调趋势；过表达PopNHX2可显著提升杨树的盐胁迫耐受性，该基因主要通过维持植株根中Na⁺/K⁺离子稳态平衡，同时增强GST、CAT等抗氧化酶活性，有效清除盐胁迫下积累的ROS、降低H₂O₂和MDA含量以缓解氧化损伤，进而改善盐胁迫下杨树的鲜重、叶绿素含量及叶片水分保持能力，维持植株正常生长。

图(3)

图 3：PopNHX2正调控杨树的盐胁迫耐受性

·PopKNAT3与PopGRF3互作解除其对PopNHX2的转录抑制

核心结论：PopKNAT3是PopGRF3的特异性互作蛋白，二者可在植物细胞核内直接发生互作；PopKNAT3不具备直接结合PopNHX2启动子的能力，其核心作用是通过与PopGRF3形成蛋白复合物，阻断PopGRF3与PopNHX2启动子的DNA结合活性，从而解除PopGRF3对PopNHX2的转录抑制作用，为PopNHX2的正常表达释放调控空间，是介导 PopGRF3-PopNHX2耐盐调控通路的关键互作因子。

图(4)

图 4：PopKNAT3与 PopGRF3互作，解除其对PopNHX2的转录抑制

·PopKNAT3通过抗氧化与离子稳态正向调控杨树耐盐性

核心结论：PopKNAT3是杨树盐胁迫响应的核心正调控因子，其耐盐调控功能与PopGRF3呈拮抗关系，也是通过互作调控PopGRF3-PopNHX2通路的关键因子；过表达PopKNAT3可显著提升杨树的盐胁迫耐受性，而干扰其表达会大幅降低植株耐盐性，该基因主要通过增强盐胁迫下抗氧化酶活性、减少ROS和MDA积累以缓解氧化损伤，同时维持植株根中Na⁺/K⁺离子稳态，还能提升植株鲜重、叶绿素含量与叶片水分保持能力，促进盐胁迫下的植株生长，最终实现耐盐性的提升。

图（5）

图 5：PopKNAT3正调控杨树的盐胁迫耐受性

·PopGRF3-PopKNAT3双重调控PopNHX2介导杨树耐盐

核心结论：本研究整合所有实验结果，构建出PopGRF3-PopKNAT3模块调控杨树耐盐性的分子机制模型，也是该研究的核心科学结论。该模型揭示了杨树应对盐胁迫存在转录水平下调 + 蛋白水平互作的双重调控模式，正常条件下PopGRF3正常表达并结合PopNHX2启动子抑制其表达，PopKNAT3低表达无法发挥拮抗作用；盐胁迫下PopGRF3表达下调、PopKNAT3表达显著上调，大量PopKNAT3与剩余PopGRF3在细胞核形成蛋白复合物，阻断其与PopNHX2启动子的结合，解除转录抑制，使PopNHX2表达上调，进而通过维持Na⁺/K⁺离子稳态、增强抗氧化酶活性清除ROS缓解氧化损伤，二者协同作用最终提升杨树盐胁迫耐受性，该模型完整阐释了三者互作调控杨树耐盐的分子通路，为木本植物耐盐调控机制提供了全新的理论框架。

图（6）

图 6：PopGRF3-PopKNAT3模块调控杨树耐盐的分子机制模型

五、研究意义与应用前景

该研究首次揭示了杨树中PopGRF3-PopKNAT3模块调控耐盐的分子机制，不仅丰富了木本植物非生物胁迫响应的转录调控网络，还为林木耐盐分子育种提供了重要的基因资源和理论指导：

1. 基因靶点：PopKNAT3和PopNHX2可作为杨树耐盐育种的正调控靶基因，通过过表达这些基因培育耐盐杨树品种；PopGRF3可作为负调控靶点，通过基因编辑敲除或敲低其表达，提升杨树耐盐性。

2. 调控模块：PopGRF3-PopKNAT3的互作模式为其他木本植物耐盐机制研究提供了参考，为解析林木非生物胁迫的 “生长-胁迫平衡” 调控提供了新视角。

3. 应用价值：杨树作为我国重要的速生造林树种，其耐盐性的提升对盐碱地造林、生态修复和林业生产具有重要的实际应用价值，该研究为盐碱地植被恢复提供了分子育种的新策略。

综上所述，这一研究成果是木本植物耐盐分子机制研究的重要突破，为后续深入解析林木非生物胁迫响应的分子网络，以及培育耐盐林木新品种奠定了坚实的基础。