液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）是一种常用于检测氨基糖苷类抗生素的方法。这种方法结合了液相色谱的分离能力和质谱的高灵敏度、高选择性检测能力，能够有效地检测动/植物中的氨基糖苷类抗生素。

技术原理

在LC-MS/MS方法中，样品首先通过液相色谱系统进行分离，得到单一化合物的混合物。然后，分离后的化合物通过电离源进行离子化处理，常用的电离源有电喷雾（ESI）和化学电离（APCI）。离子化后的化合物进入质谱仪，在那里它们按照质荷比（m/z）进行分析和检测。通过质谱检测器得到的数据进行处理和分析，可以得到化合物的质量、分子结构以及相对含量等信息。

方法优势

高灵敏度与选择性：LC-MS/MS能够实现极低浓度下的检测，特别适合于复杂基质中微量氨基糖苷类抗生素的分析。

强大的定性定量能力：质谱提供分子量和结构信息，有助于精确识别和量化目标化合物，即使在复杂基质中也能保持高准确度。

降低基质效应：质谱的高选择性减少了基质干扰，提升了分析的可靠性和重复性。

色谱柱选择

HILIC RAC混合离子交换色谱柱：这种色谱柱以高纯硅胶为基质，提供独特的反相、阴离子交换、阳离子交换等多重表面化学作用，适用于水溶性极性化合物的高效和高选择性分离。它特别适用于氨基糖苷类化合物的测定，可以实现多种氨基糖苷的同时分析。

亲水性色谱柱：这种色谱柱具有全新的保留机制，用于样品的保留和分离，配合高效液相色谱-质谱联用法，可以建立快速有效的同时测定氨基糖苷类抗生素含量的方法。

C18色谱柱：C18色谱柱是一种常用的反相色谱柱，适用于多种化合物种类分析，包括氨基糖苷类抗生素。它具有较高的化学稳定性和机械强度，可以帮助解决氨基糖苷类抗生素的色谱分析问题。

Obelisc R色谱柱：这种色谱柱用于液相色谱流动相以及质谱条件的优化，对于氨基糖苷类抗生素的保留与分离能力表现出色，适用于多种氨基糖苷类抗生素的同时检测。

流程概述

样品前处理

1. 提取：从动物组织（如肌肉、肝脏）或植物材料（如谷物、蔬菜）中提取氨基糖苷类抗生素。常用的提取溶剂包括乙腈、甲醇、乙酸缓冲液等，根据目标抗生素的特性选择最合适的溶剂。

2. 净化：提取后，样品可能含有多种干扰物，如蛋白质、脂质、色素等。使用固相萃取（SPE）或免疫亲和层析等方法进行净化，以提高检测的准确性和灵敏度。

3. 浓缩与复溶：将净化后的样品进行浓缩，然后用适宜的溶剂复溶，准备上机分析。

液相色谱条件

1. 色谱柱：选择适合氨基糖苷类抗生素分离的反相色谱柱，如C18柱。

2. 流动相：使用水相（含酸或缓冲液）和有机相（如甲醇或乙腈）的混合物作为流动相，根据目标化合物的性质调整比例和pH值。

3. 流速与梯度洗脱：设定适当的流速，通常为0.2-1 mL/min。采用梯度洗脱模式，以优化分离效果。

质谱条件

1. 电离模式：氨基糖苷类抗生素通常采用电喷雾电离（ESI）模式，正离子模式下检测。

2. 多反应监测（MRM）：选择目标化合物的母离子和子离子进行监测，以提高检测的特异性和灵敏度。

数据分析

1. 标准曲线构建：使用标准品构建标准曲线，以确定样品中氨基糖苷类抗生素的浓度。

2. 定量分析：根据样品中目标化合物的响应值，结合标准曲线进行定量。

注意事项

1. 基质效应：动植物样本基质复杂，需关注基质效应，可通过内标法或基质匹配标准曲线法进行校正。

2. 回收率与精密度：定期检查方法的回收率和精密度，确保检测结果的可靠性。

3. 质控与校准：定期进行仪器校准和质控，使用质控样品监控分析过程中的稳定性。

如何优化检测灵敏度

样品前处理优化

在样品前处理过程中，控制上样溶液的pH值至6~7是关键，因为不同氨基糖苷类药物在不同pH条件下的回收率有所不同。例如，STREP、DHSTREP、SPEC、HYGRO在酸性条件下回收率较低，而AMIK、KANA、APRA在碱性条件下回收率较低。因此，通过调整pH值，可以提高这些抗生素的回收率，进而提高检测灵敏度。

色谱条件优化

选择合适的色谱柱对于提高氨基糖苷类抗生素的检测灵敏度至关重要。研究表明，Obelisc R色谱柱对10种氨基糖苷的分离效果最好，这是因为氨基糖苷类药物为碱性化合物，在pH小于其pKa时，目标物离子化，与SIELC Obelisc R键合的羧基相互作用，实现化合物的保留。相比之下，BEH Amide色谱柱由于酰氨基为中性基团，离子交换作用较小，而BEH HILIC色谱柱上硅醇基与氨基糖苷类药物之间存在强氢键作用和离子交换作用，导致峰宽较宽，峰形较差。

质谱条件优化

氨基糖苷类抗生素的结构中含有多个羟基，极性很强，因此选择电喷雾离子源。在正离子和负离子模式下，正离子模式的响应通常高于负离子模式，这是因为氨基糖苷类物质的结构中含有多个伯胺或仲胺基团，具有弱碱性，易被电离成正离子。在全扫描模式下，选择化合物的分子离子峰，并在产物离子扫描模式下，以各个化合物的分子离子峰为母离子，进行二级质谱扫描，选择两对丰度较强、基质干扰较小的离子为子离子，以优化质谱条件。

基质效应考虑

在LC-MS/MS分析中，基质效应可能会影响检测灵敏度。因此，需要选择适当的溶剂和条件来最小化基质效应，确保分析结果的准确性。

常见基质效应

基质效应的定义

基质效应是指在液相色谱-质谱（LC-MS/MS）分析过程中，样品基质中的成分对目标分析物的信号产生影响的现象。这种影响可能表现为增强或抑制目标分析物的响应，从而影响分析结果的准确性和重复性。

氨基糖苷类抗生素的基质效应

氨基糖苷类抗生素是一类具有高度亲水性的化合物，它们含有多个氨基和羟基，因此在LC-MS/MS分析中容易受到基质效应的影响。常见的基质效应包括：

1. 离子抑制：氨基糖苷类抗生素在分析过程中可能会与样品基质中的其他离子发生竞争性吸附，导致分析物的信号减弱。

2. 离子增强：相反，某些情况下，样品基质中的离子可能会与分析物形成稳定的离子对，从而增强分析物的信号。

3. 基质效应的选择性：不同的基质成分可能对不同的氨基糖苷类抗生素产生不同程度的影响，这使得分析方法的普适性受到限制。

减少基质效应的策略

1. 样品前处理：通过适当的样品前处理技术，如固相萃取（SPE）或液液萃取（LLE），可以去除或减少样品基质中的干扰物质。

2. 选择合适的色谱条件：使用离子对反相（RP）或亲水相互作用（HILIC）色谱模式，以及3. 选择合适的离子对试剂，可以改善分析物的分离和检测。

3. 使用同位素稀释法：通过向样品中添加稳定同位素标记的分析物，可以校正基质效应带来的误差。