通过使用反相色谱柱，并根据不同维生素的性质选择合适的流动相和梯度洗脱程序，可以实现有效的分离。所得结果的重现性好，精密度高，加标回收率通常在85%～110%之间。
在实际应用中，不同样品的前处理对于色谱柱的保护和结果的准确性至关重要。例如，脂溶性维生素的样品可能需要经过皂化处理后提取至有机溶剂中，而水溶性维生素的样品则可能需要经过酶处理或酸碱处理以改善其在色谱柱中的分离效果。
此外，高效液相色谱法还可以实现维生素各个异构体的很好分离，并且可以同时对多种维生素进行有效分析，大大提高了检测效率。这使得HPLC在维生素检测中具有广阔的应用前景。
工作原理
高效液相色谱法（HPLC）是一种用于分离、鉴定和定量液体样本中的半挥发和不挥发化合物的分析技术。它的工作原理基于色谱法的分离原理，即不同物质在固定相和流动相之间的分配平衡。在HPLC中，流动相是携带待测组分通过色谱柱的液体，而固定相则是色谱柱中的填料，它固定在色谱柱中并起到吸附和解析组分的作用。流动相和固定相的选择对于HPLC的分离效果至关重要。
流程概述
1. 样品前处理
样品制备：首先需要对样品进行适当的处理，如缩分、粉碎或均质化，然后避光冷藏保存。
皂化：对于某些维生素，如维生素A和维生素E，需要进行皂化处理。这通常涉及将固体样品或液体样品与氢氧化钾等碱性溶液反应，以释放出维生素。
提取：首先需要将样品中的维生素从其生物基质中提取出来。这通常涉及到使用适当的溶剂，如乙醇、甲醇或水，有时还需要加入抗氧化剂以防止维生素降解。
净化：提取液可能含有许多干扰物质，因此需要通过固相萃取（Solid Phase Extraction, SPE）等方法进行净化，以去除杂质，提高维生素的纯度。
浓缩与稀释：根据检测需要，可能需要对提取液进行浓缩或进一步稀释，以达到合适的浓度范围。
2. 样品制备
过滤：使用0.45μm的滤膜过滤样品溶液，以去除任何可能堵塞HPLC系统的颗粒物。
进样：将处理后的样品溶液转移到HPLC的自动进样器中，准备进行分析。
3. HPLC分析
选择合适的色谱柱：根据目标维生素的性质，选择适合的反相或正相色谱柱。
设定流动相：流动相的选择取决于目标维生素的极性和溶解性，通常包括水、甲醇、乙腈等，并可能添加酸、盐或缓冲液来调整pH值和离子强度。
优化色谱条件：包括流速、温度、梯度洗脱程序等，以获得最佳的分离效果。
检测：使用紫外-可见光检测器（UV-Vis）、荧光检测器或电化学检测器等，根据维生素的特性选择最敏感的检测方式。
4. 数据分析
峰识别：通过与标准品的保留时间对比，确认每个峰代表的维生素种类。
定量分析：使用外标法或内标法，根据峰面积或峰高计算维生素的含量。
5. 结果验证
重复性测试：多次测量同一样品，评估方法的重复性和准确性。
回收率实验：通过向已知含量的样品中添加一定量的标准维生素，再进行检测，计算回收率，验证方法的可靠性。
注意事项
在整个过程中，应严格控制实验环境，避免维生素的氧化或降解。
每次分析前后，都要对色谱系统进行彻底清洗，以防止交叉污染。
根据具体维生素的性质，可能需要调整上述流程中的某些步骤，例如使用特定的前处理方法或检测条件。
根据维生素的性质选择合适的流动相和梯度洗脱程序
选择合适的流动相
流动相的选择对于维生素的分离效果至关重要。对于水溶性维生素，通常选择含有一定比例的水和有机溶剂（如甲醇或乙腈）的混合溶液作为流动相。例如，在分析维生素C时，可以使用0.1 mol·L^-1醋酸钠溶液和甲醇的混合溶液作为流动相。对于脂溶性维生素，流动相通常包含更高比例的有机溶剂，以增强其在流动相中的溶解度。
设计梯度洗脱程序
梯度洗脱程序是通过改变流动相的组成比例，从而实现不同维生素的有效分离。梯度洗脱程序通常包括起始条件、梯度变化阶段和终止条件。例如，在分析复合维生素注射液中的11种维生素时，可以采用以下梯度洗脱程序：起始时流动相为95%醋酸钠溶液和5%甲醇，经过一段时间后逐渐减少醋酸钠溶液的比例，增加甲醇的比例，直至全部为甲醇，然后再恢复到起始条件。
注意事项
在设计流动相和梯度洗脱程序时，需要考虑维生素的化学性质、稳定性以及色谱柱的特性。此外，还需要根据实际样品的复杂程度和分析目的来调整流动相的组成和梯度洗脱的细节。在实验过程中，可能需要多次优化才能获得满意的分离效果。
技术优势
高速分析：HPLC的分析速度快，通常可以在几分钟到几十分钟内完成分析，这对于需要快速得到结果的场合非常适用。
高分辨率：HPLC能够有效地将复杂混合物中的各个组分进行分离，尤其是对于分子量相近、结构相似的化合物，HPLC展现出良好的分离能力。
高灵敏度：HPLC的检测器如紫外-可见光检测器、荧光检测器等具有非常高的灵敏度，能够检测到非常低浓度的样品组分。
广泛的适用性：HPLC几乎可以用于所有可溶性的有机化合物的分析，包括高沸点、不易挥发的、热稳定性差的以及具有生理活性的物质。
重复性好：HPLC系统具有高度的稳定性和重现性，只要操作条件控制得当，多次分析同一样品时，色谱图几乎相同。
自动化程度高：现代的HPLC系统已经高度自动化，包括自动进样、自动梯度洗脱、自动数据处理等功能，大大减轻了操作人员的劳动强度，提高了分析效率。
样品消耗少：HPLC的进样量通常很小，一般在几微升到几十微升之间，这对于珍贵样品的分析尤为重要。
柱后衍生化：HPLC系统可以与柱后衍生化技术结合，对不易检测的化合物进行衍生化，转化为易于检测的化合物，从而扩大了HPLC的检测范围。
