基本原理
液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）是一种结合了液相色谱的分离能力和质谱的高灵敏度和选择性质量分析能力的技术。在测量动/植物中的有机酸时，首先通过液相色谱将样品中的有机酸进行分离，然后利用质谱对分离出的有机酸进行结构分析，从而实现对有机酸的快速分离和精确定性/定量。
可检测有机酸类型
液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）在检测植物中的有机酸时表现出较高的灵敏度。这种技术可以用于测定多种植物源性食品中的有机酸物质，包括但不限于富马酸、反式-乌头酸、己二酸、没食子酸、香草酸、绿原酸、咖啡酸、丁香酸、对香豆酸、阿魏酸、对羟基苯甲酸、水杨酸、2,5-二羟基苯甲酸和3,4-二羟基苯甲酸等。此外，该方法还可以用于检测酒类产品中的10种有机酸，如乙酸、草酸、丙二酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸、马来酸、乙醇酸、富马酸等。
LC-MS/MS法的优点在于其操作简捷、灵敏度高、分析速度快，可以满足多种植物源性样品中有机酸物质的定性定量分析。该方法能够将目标物与其他杂质组分的色谱峰实现良好的分离，在0.1~5.0 ug/mL的浓度范围内建立标准曲线，线性关系良好。此外，该方法的检测限（LOD）和定量限（LOQ）非常低，分别为0.0003~0.010 ug/mL和0.001~0.033 ug/mL，这意味着即使是极微量的有机酸也能够被检测出来。
技术优势
液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）相对于传统色谱法，主要优势体现在以下几个方面：
高灵敏度和选择性：LC-MS/MS能够通过至少两个物理特征（母离子和产物离子质量）来识别分析物，这使得它对于许多分析物具有优异的选择性。此外，软电离技术的引入使得低分子量分子可以在液相中电离，从而实现与液相色谱的有效耦合。
高通量和自动化：LC-MS/MS系统通常配备有先进的自动进样和数据处理软件，能够快速处理大量样本，大大提高了分析效率和重复性。
结构信息丰富：除了能够提供定量分析外，LC-MS/MS还能够提供关于化合物结构的详细信息，如分子量和可能的结构式，这对于未知化合物的鉴定和已知化合物的确认非常有用。
样品准备简单：与传统色谱法相比，LC-MS/MS通常不需要复杂的样品前处理步骤，如衍生化或化学修饰，这简化了实验流程并减少了潜在的误差。
适用范围广：LC-MS/MS可以用于分析各种类型的化合物，包括极性和非极性化合物，这使得它在化学、生物学、环境科学和医学等多个领域都有着广泛的应用。
流程概述
1. 样品采集与前处理
a. 样品采集
从动物或植物组织中精确称取一定量的样本。
确保样本新鲜或正确储存，避免有机酸降解。
b. 样品制备
研磨: 将样品冷冻干燥后研磨成粉末。
提取: 使用合适的溶剂（如甲醇、乙腈或水）进行提取。提取过程可能需要超声波辅助或加热，以提高提取效率。
净化: 通过固相萃取（SPE）、液-液萃取等方式去除杂质，提高目标化合物纯度。
浓缩与复溶: 使用氮吹或其他方法浓缩提取液，然后用流动相复溶，准备进样。
2. 标准曲线制备
制备一系列不同浓度的有机酸标准溶液，用于建立标准曲线，以便后续定量分析。
3. 液相色谱分离
流动相选择: 选择适合目标有机酸的流动相，通常为水与有机溶剂（如甲醇、乙腈）的混合物，可能含酸性或碱性添加剂以改善分离。
色谱柱选择: 根据有机酸的性质选择合适的色谱柱，如反相柱、离子交换柱等。
梯度洗脱: 设定适当的梯度洗脱程序，以优化分离效果。
4. 质谱检测
电离源: 选择电喷雾电离（ESI）或大气压化学电离（APCI）等电离方式，根据有机酸的性质和检测要求决定。
MS/MS扫描: 选定母离子进行碰撞诱导解离（CID），生成特征子离子，提高定性与定量的准确性。
数据采集: 设置质谱参数，开始数据采集。
5. 数据分析
质谱数据处理: 使用专业软件进行数据处理，包括峰识别、积分、同位素校正等。
定性与定量: 对比标准曲线，确定样品中有机酸的种类及其浓度。
6. 结果验证
重复性测试: 通过多次测量同一标准品，评估方法的重复性和稳定性。
回收率实验: 通过添加已知量的标准品到样品中，评估方法的回收率，确认方法的准确性。
整个过程需要严格控制实验条件，确保数据的可靠性和准确性。此外，定期维护和校准仪器也是保证分析结果的关键。
提高有机酸的分离效果
液相色谱（HPLC）是一种常用的分析技术，用于分离和鉴定混合物中的各个组分。对于有机酸的分离，优化HPLC条件尤为重要，因为有机酸的化学性质决定了它们在色谱柱中的行为。以下是一些优化HPLC条件以提高有机酸分离效果的建议：
选择合适的色谱柱：反相色谱柱（如C18柱）通常用于有机酸的分离，但有时需要根据有机酸的性质选择不同的固定相材料，如亲水相互作用色谱柱（HILIC）。
流动相的选择：流动相的选择对有机酸的分离效果有显著影响。通常需要在流动相中添加适量的酸（如三氟乙酸）或缓冲盐（如NaH2PO4）以增加有机酸的保留时间。此外，流动相的pH值也需要适当调整，以控制有机酸的电离状态，从而影响其在色谱柱中的保留行为。
流速和温度的优化：流速和温度的选择会影响分析物在色谱柱中的迁移速度和分离效率。一般来说，较低的流速有助于提高分离度，而适宜的温度则可以改善峰形和减少分析时间。
检测波长的选择：有机酸通常具有紫外吸收特性，因此选择合适的检测波长对于提高检测灵敏度和选择性至关重要。通常可以通过实验确定最佳的检测波长。
样品前处理：适当的样品前处理可以去除可能干扰分析的杂质，提高分析的准确性。例如，可以使用蛋白质沉淀剂或固相萃取小柱来预处理样品。
方法验证：在优化了HPLC条件之后，需要对方法进行验证，确保其满足预期的分离效果和分析目的。
常见质谱模式
全扫描模式（Scan)
全扫描模式是最常用的扫描方式之一，它可以覆盖被测化合物的分子离子和碎片离子的质量范围，得到化合物的全谱。这种模式适用于未知化合物的定性分析。
选择离子监测模式（SIM)
选择离子监测模式不是连续扫描某一质量范围，而是跳跃式地扫描某几个选定的质量，得到的不是化合物的全谱。主要用于目标化合物检测和复杂混合物中杂质的定量分析。
子离子扫描模式（Product Ion Scan)
子离子扫描模式在一级四极杆（Q1）固定扫描电压选择某一质量离子进入后，二级四极杆（Q2）对这个选定的母离子进行裂解和全扫描，得到的是选定母离子的全谱。这种模式有助于分析化合物结构。
母离子扫描模式（Precursor Ion Scan)
母离子扫描模式选择母离子进入，经Q2裂解后，Q3固定扫描，扫描电压，检测特定的离子，则该离子是由选择的母离子产生的。得到的是能产生特定离子的母离子的谱图。
中性丢失扫描模式（Neutral Loss Scan)
中性丢失扫描模式扫描所有离子，经过Q2碎裂后，Q3与中性碎片的质量差联动扫描，检测丢失该固定质量的中性碎片。得到中性碎片谱，有助于分析同类化合物的结构特征。
多重反应监测模式（Multiple Reaction Monitoring, MRM)
MRM模式选择特定离子进入，经Q2碎裂后，Q3仍检测特定离子。只有符合特定条件的离子才能被检测到。选择性、专属性更强，适用于定量分析。
