植物内源激素如生长素（IAA）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CKs）、脱落酸（ABA）、茉莉酸（JA）等，在植物生长发育和逆境响应中起着关键作用，因此准确测定这些激素的含量对于理解植物生理过程至关重要。在植物样品中，激素含量通常很低，且植物体成分复杂，干扰组分多，这给激素的分析测定工作带来了挑战。
然而，LC-MS/MS技术能够有效地解决这些问题。通过LC-MS/MS技术，可以对植物样品中的植物内源激素进行分离和定量分析。首先，使用液相色谱技术对样品中的化合物进行分离，然后将分离得到的化合物进一步通过串联质谱进行检测和定量。这种方法可以提高对植物内源激素的灵敏度和准确性。
独特优势
高灵敏度：LC-MS/MS能够检测到低至皮克级别（pg/mL）的激素浓度，这对于植物激素这种通常存在于极微量的化合物来说尤为重要。
高选择性：该技术能够区分结构相似的激素和代谢物，即使在复杂的植物基质中也能准确识别目标植物激素，并排除其他干扰物质。
高分辨率：LC-MS/MS能够通过质谱的高分辨率功能，准确区分不同植物激素的同分异构体或同系物，确保检测结果的精准性。
快速、自动化和高通量：LC-MS/MS技术可以实现对大量样品的快速分析，提高实验效率。同时，LC-MS/MS系统可以实现自动化操作，减少人为误差，提高数据的可重复性和可比性。
多通道检测：一管血可同时检测多种目标化合物，这在多种激素检测、多种维生素检测、新生儿筛查、血药浓度监测等领域被广泛应用。
样品用量少、分析速度快、检测范围广：与传统检测方法相比，LC-MS/MS方法具有样品用量少、分析速度快、检测范围广等优点。
特异性好：LC-MS/MS方法对样本进行干扰实验的研究，通过色谱分离使干扰物质在不同的时间出峰，可以有效的消除内源性物质、同分异构体、其他代谢物的干扰，保证检测结果的准确性。
准确度高：与传统检测方法比较，LC-MS/MS技术已成为目前生物样品中小分子化合物定性、定量测定的金标准。其高准确性和特异性，弥补了免疫分析法对小分子化合物检测的缺陷。
基本步骤
样品准备：收集植物组织样本，如叶片、根、花或果实，进行快速冷冻干燥或液氮冷冻保存以减少激素降解。随后，使用适当的溶剂（如乙腈、甲醇或含水有机溶剂混合物）提取激素。提取过程中可能需要加入内标物以校正样品制备过程中的损失。
样品净化：提取液通过固相萃取（SPE）或免疫亲和层析等技术进行净化，以去除杂质，提高目标化合物的纯度和回收率。
液相色谱分离：将净化后的样品注入液相色谱系统。利用不同类型的色谱柱（如反相C18柱）和流动相（如水和甲醇、乙腈的梯度洗脱），根据化合物的疏水性、极性等特性实现分离。
质谱检测：经过色谱分离的组分进入质谱仪，通过电喷雾离子化（ESI）或其他离子化方式形成离子。然后在质谱中进行多级质谱（MS/MS）分析，通过特定的母离子和子离子对进行选择性监测（SRM或MRM模式），以提高检测的特异性和灵敏度。
数据分析：使用软件处理LC-MS/MS数据，根据保留时间和特征离子比对标准品或内标物进行定性和定量分析。
结果验证：确保方法的准确性、精密度和重复性符合要求。通常，通过分析标准曲线和质量控制样品来评估方法性能。
如何提高准确性和特异性
优化样品前处理：通过使用特定的溶剂混合物和温度进行提取，可以有效地从植物组织中提取植物激素，同时减少其他次生代谢产物的干扰。例如，使用异丙醇、水和盐酸的混合液在低温下提取激素，并加入相应的氘代内标物质，以便于后续的定量分析。
选择合适的色谱柱和流动相：使用C18色谱柱和乙腈-0.1%乙酸水溶液作为流动相，可以实现植物激素的有效分离。梯度洗脱和适当的流速设置有助于缩短分析时间，同时保持良好的分离效果。
采用多反应监测（MRM）模式：这种模式可以提高检测的选择性和灵敏度，因为它专门针对特定的植物激素离子对进行监测，从而减少了其他物质的干扰。
使用电喷雾电离源（ESI）：在负离子模式下进行分析，可以提高植物激素的检测灵敏度，因为许多植物激素在负离子模式下更容易被检测到。
内标法定量：通过使用与待测植物激素性质相似的内标物质，可以校正由于操作条件波动导致的分析误差，提高结果的准确度。
化学增敏策略：例如，通过化学移位术，可以在质谱分析中有效检测到原本无法检测的植物激素，提高了检测的灵敏度和准确性。
固相微萃取技术：虽然传统的固相微萃取技术在植物样品分析中存在一些局限性，但通过改进涂层材料或萃取模式，可以提高植物激素的富集率和分析的准确性。
如何解决样品的干扰问题
优化样品前处理：通过使用QuEChERS方法，可以减少基质干扰，提高分离度，简化操作，缩短分析时间，提高灵敏度和定量准确性。
选择合适的提取溶剂和净化材料：研究表明，不同的提取溶剂和净化材料对植物样品中的激素提取效率有显著影响。例如，甲醇、乙腈、0.1%氨水乙腈、1%乙酸乙腈等溶剂，以及PSA、C18净化剂等材料，都需要经过优化以获得最佳的提取和净化效果。
使用高效液相色谱柱：选择合适的色谱柱对于提高分离效率和减少干扰至关重要。例如，使用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱进行分离，可以在短时间内完成色谱分离，提高分析效率。
优化质谱条件：通过调整质谱参数，如离子源电压、碰撞能量等，可以提高目标分析物的检测灵敏度和选择性，减少干扰。
使用多反应监测（MRM）模式：MRM模式可以提高分析的选择性和灵敏度，减少背景噪声，从而更有效地检测和定量植物样品中的激素。
建立标准曲线和进行回收率实验：通过建立标准曲线和进行回收率实验，可以评估方法的准确性和可靠性，确保分析结果的准确性。
样品前处理减少基质干扰
样品均质：首先，将植物样品进行粉碎和均质处理，以便于后续的提取过程。这一步骤有助于打破细胞壁，释放出目标化合物，同时减少基质效应。
提取分离：使用乙腈或酸化乙腈作为提取剂，通过振荡法萃取植物样品中的目标化合物。在提取过程中，加入适量的盐类（如硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠），以促进分层和提高提取效率。
净化：提取液经过净化步骤，以去除基质中的干扰物质。这通常通过使用分散基质固相萃取（d-SPE）技术实现，其中加入特定的吸附剂（如乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、石墨化碳黑（GCB）等）与基质中的有机酸、脂肪酸、碳水化合物等干扰物结合，通过离心方式去除，从而达到净化的目的。
浓缩：净化后的上清液进行浓缩，通常使用氮吹或旋转蒸发器去除溶剂，以便于后续的分析检测。
